Eine eingeschränkte Mobilität bestimmter funktioneller Gruppen reduziert Anti

Jul 25, 2023

Scientific Reports Band 6, Artikelnummer: 22478 (2016) Diesen Artikel zitieren

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Die derzeit am häufigsten verfügbaren Krebsbehandlungen sind Strahlen- und Chemotherapie. Diese Therapien haben jedoch Nachteile, wie z. B. die Einschränkung der Lebensqualität und die geringe Wirksamkeit der Strahlentherapie bei multiplen Metastasen. Um diese Effekte abzuschwächen, haben wir ein Krebsmedikament in eine biokompatible Matrix eingekapselt. In-vitro-Untersuchungen deuten darauf hin, dass dieses Bio-Nanokomposit in der Lage ist, mit Krebszellen zu interagieren und morphologische Veränderungen hervorzurufen. Unterdessen wurden keine Veränderungen in Monozyten und Fibroblasten beobachtet, was darauf hindeutet, dass dieses System den Wirkstoff in lebenden Organismen mit verringerter Clearance-Rate und Toxizität transportieren könnte. Zur Untersuchung der Trägerstruktur sowie zur Beurteilung der Arzneimittelmobilität innerhalb des Bio-Nanokomposits wurden Röntgenstrahlen und Neutronen eingesetzt. Anhand dieser einzigartigen Daten zeigen wir, dass eine teilweise Einschränkung der Mobilität aktiver Gruppen des Arzneimittelmoleküls darauf hindeutet, warum dieses Trägerdesign für gesunde Zellen möglicherweise sicherer ist.

Krebs ist weltweit eines der größten Gesundheitsprobleme. In Europa ist die Inzidenz dieser Krankheit von 3,2 Millionen Neuerkrankungen im Jahr 2008 auf 3,45 Millionen im Jahr 2012 gestiegen, mit einer Sterblichkeitsrate von rund 50 %1,2. Paclitaxel (PTX) ist eines der wirksamsten Medikamente, die derzeit zur Behandlung von Brust-, Lungen- und Eierstockkrebs verfügbar sind3,4,5,6. Seine Funktion basiert auf einem einzigartigen Mechanismus, der die Stabilisierung von Zellmikrotubuli beinhaltet, was seinen therapeutischen Erfolg erklärt7. Allerdings bestehen bei diesem Medikament immer noch erhebliche Einschränkungen, hauptsächlich aufgrund seiner geringen Wasserlöslichkeit (~0,4 μg/ml) und natürlich seiner Toxizität für gesunde Zellen. Um seine Löslichkeit zu erhöhen, wird ein Arzneimittel häufig in organischen Lösungsmitteln wie dehydriertem Ethanol und polyoxyethyliertem Rizinusöl formuliert. Leider verursacht dieser Ansatz viele Nebenwirkungen, wie Überempfindlichkeitsreaktionen und Hyperlipidämie8.

Daher ist die Entwicklung oder Modifikation von Systemen zur Aufnahme und Abgabe von Krebsmedikamenten von größter Bedeutung9. Eine vielversprechende Alternative ist die Verwendung löslicher polymerer Nanoträger zur Steuerung der Pharmakokinetik und Bioverteilung des Arzneimittels10. Insbesondere das Biopolymer Chitosan hat aufgrund seiner Biokompatibilität und biologischen Abbaubarkeit großes Interesse in biomedizinischen Anwendungen geweckt11. Dieser Weg wurde auch als Verkapselungsmatrix für PTX mit vielversprechenden Ergebnissen verwendet12,13. Weitere Verbesserungen können durch die Modifizierung der Oberflächenmerkmale des Arzneimittelabgabesystems mit Verbindungen geringer Toxizität erzielt werden, wodurch möglicherweise auch die Adhäsion des Trägers an Krebszellen erhöht werden kann14. Zu diesem Zweck ist die Verwendung von Hydroxylapatit (Ca10(PO4)6(OH)2, im Folgenden HAP), dem wichtigsten anorganischen Bestandteil menschlicher Knochen und Zähne, ein hervorragender Kandidat. Im Nanomaßstab weist HAP eine besondere Biokompatibilität sowie Nichtimmunogenität, nicht entzündliches Verhalten, hohe Osteokonduktivität und gute Adhäsion an verschiedene Arten von Krebszellen auf15,16. Noch interessanter ist, dass HAP-Nanopartikel (nHAP) eine hemmende Wirkung auf die Proliferation von Krebszellen haben, während sie bei gesunden Zellen eine geringere Wirkung haben16,17,18,19. Folglich kann die Kombination der Eigenschaften von nHAP mit Biopolymeren in einem Nanokomposit zu Arzneimittelabgabesystemen mit inhärenten Auswirkungen auf Krebszellen führen. Um jedoch die nHAP-Eigenschaften voll ausnutzen zu können, müssen sich diese Nanopartikel in der Außenschicht des Verbundwerkstoffs befinden20. Zusätzlich zu den Vorteilen, die sich aus der Kombination eines Biopolymers mit nHAP ergeben, bietet der Einbau eines Arzneimittels in Nanoträger mit magnetischen Eigenschaften, beispielsweise Mn-Zn-Ferrit-Nanopartikel, bemerkenswerte neue Möglichkeiten. Zum Beispiel die Führung des Arzneimittelträgers entlang des Körpers mithilfe eines externen Magnetfelds sowie die Überwachung seiner Position durch Gradiometer oder Magnetresonanztomographie21,22,23,24. Schließlich werden auch magnetische Hyperthermie-Behandlungen praktikabel, die eine vielversprechende Technik in Kombination mit Radio- und Chemotherapie darstellen25,26,27.

Den oben beschriebenen Ideen folgend, haben wir PTX in ein Bio-Nanokomposit (im Folgenden Bio-NCP und Bio-NCP + PTX) eingekapselt, das aus mit Chitosan beschichteten Mn-Zn-Ferrit-Nanopartikeln besteht und dessen Oberfläche mit nHAP28 modifiziert wurde.

Morphologische In-vitro-Tests, die mithilfe von Rasterelektronenmikroskopie (REM) und energiedispersiver Röntgenspektroskopie (EDS) auf der Grundlage einer von unserer Gruppe entwickelten Methodik durchgeführt wurden, ermöglichten einen vorläufigen Einblick in die Wechselwirkung zwischen Zellen und Nanopartikeln, ohne dass dies erforderlich war fluoreszierende oder radioaktive Marker in den Nanopartikeln. Die Ergebnisse legen nahe, dass normale Monozyten und zwei verschiedene Arten von Tumorzellen unterschiedlich mit dem Bio-NCP interagieren. Während bei den gesunden Zellen keine Toxizität beobachtet wurde, wurden morphologische Veränderungen hauptsächlich bei Dickdarmkrebszellen festgestellt.

Die recht anspruchsvolle Charakterisierung des formulierten Bio-NCP + PTX und Einblicke in die Dynamik des eingekapselten und freigesetzten Arzneimittels wurden durch den Einsatz fortschrittlicher Mikroskopie- bzw. Spektroskopietechniken erreicht. Dazu gehören die Nahkanten-Röntgenabsorptions-Feinstrukturspektroskopie (NEXAFS), die Rastertransmissions-Röntgenmikroskopie (STXM) und die inelastische Neutronenstreuung (INS).

NEXAFS ermöglichte aufgrund der Wechselwirkung von Röntgenstrahlen mit der K-Schale der Kohlenstoffatome die Charakterisierung verschiedener organischer Gruppen, ohne dass die magnetischen Nanopartikel das Ergebnis beeinflussten29. Durch die Kombination von NEXAFS mit STXM wurde die Karte der chemischen Zusammensetzung zusammen mit der visuellen Analyse der PTX-Verteilung des Bio-NCP erhalten. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass PTX im polymeren Teil des Trägers verteilt ist.

Schließlich wurde der Vergleich der Dynamik des eingekapselten Arzneimittels mit der der reinen Form durchgeführt – ein wichtiger Schritt zum Verständnis und zur Kontrolle der Wechselwirkungen zwischen Polymer und Arzneimittel und eine der wichtigsten Fragen bei der Weiterentwicklung dieser Technologie hin zu klinischen Studien Kombination von INS mit Berechnungen der Dichtefunktionaltheorie (DFT). Diese Ergebnisse ermöglichten die Zuordnung der Schwingungsmoden, einschließlich derjenigen, die innerhalb des Wirkstoffträgers beobachtet wurden30,31,32. Mit diesem Ansatz zeigen wir, dass die Phenyl- und Acetylschwingungsmoden zwar durch die Einkapselung eingeschränkt werden, sich aber nach der Wirkstofffreisetzung wiederherzustellen scheinen. Dies ist wichtig, da bekannt ist, dass die PTX-Aktivität mit der Mobilität dieser Gruppen zusammenhängt7.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Gesamtheit unserer Ergebnisse darauf hindeutet, dass das vorgeschlagene Bio-NCP neue Möglichkeiten für den aufstrebenden Bereich der Arzneimittelabgabe eröffnen kann.

Das Potenzial des Bio-NCP als PTX-Träger wird durch In-vitro-Tests mit Monozyten hervorgehoben, die dazu neigen, die Phagozytose von Fremdpartikeln oder -molekülen im menschlichen Körper zu fördern und sie daran zu hindern, Zielgewebe zu erreichen.

Morphologische Veränderungen von Monozyten eines gesunden Spenders (Kontrollgruppe) (Abb. 1 (a)) wurden visuell als Reaktion auf ihren 2-stündigen Kontakt mit den reinen Ferrit-Nanopartikeln (Abb. 1 (b)) und mit dem Bio-NCP bewertet (Abb. 1(c)) mittels REM. In beiden Fällen wurden keine nennenswerten morphologischen Veränderungen beobachtet. Anschließend wurden die Zellen mittels EDS analysiert, um Regionen mit hoher Fe-Konzentration zu bestimmen, dem Hauptbestandteil der Mn-Zn-Ferrit-Nanopartikel, die den Kern des Bio-NCP bilden. Eine solche Beobachtung liefert Einblicke in die Wechselwirkungen zwischen den Zellen und den Nanopartikeln. Dies ist in der Tat beim Test mit Mn-Zn-Ferrit der Fall, wo Zellen mit hoher Fe-Konzentration, grün markiert und durch die Pfeile in der repräsentativen REM-Aufnahme hervorgehoben, beobachtet wurden, wie in Abb. 1(b) gezeigt. Dieses Szenario ändert sich durch die Modifizierung der Nanopartikel mit dem Bio-NCP, wobei die Zellen nach dem Test eine geringere Fe-Konzentration aufweisen, wie in Abb. 1(c) dargestellt. Dies deutet darauf hin, dass die mit nHAP modifizierte biopolymere Beschichtung die Reaktion der Abwehrzellen hemmt, was bekanntermaßen die Funktion des Trägers beeinträchtigt33.

Repräsentative REM-Bilder und EDS-Analysen normaler Monozyten eines gesunden Spenders (Kontrollgruppe) (a) und der Zellen nach 2-stündigem Kontakt entweder mit Mn-Zn-Ferrit-Nanopartikeln (b) oder mit dem Bio-NCP (c). Hohe Fe-Konzentrationen, grün markiert, deuten auf eine Aufnahme aus den Mn-Zn-Ferrit-Nanopartikeln hin.

Abbildung 2(a) zeigt repräsentative REM-Bilder von Kontrollgruppen von Dickdarmkrebszellen (oben) und Lungenkrebszellen (unten), während Abbildung 2(bc) die Zellen nach 2-stündigem Kontakt mit Mn-Zn-Ferrit und Bio-NCP-Nanopartikeln zeigt. jeweils. Die Zellen wurden auch EDS-Analysen unterzogen, wie durch die grünen Flecken dargestellt, die bei den mit reinen Mn-Zn-Ferrit-Nanopartikeln getesteten Zellen deutlicher zu erkennen sind (Abb. 2(b).

Repräsentative SEM-Bilder und EDS-Analysen von In-vitro-Analysen von Dickdarm- (HCT116) und Lungenkrebszellen (3LL) (Kontrolle) (a) und den Zellen nach 2-stündigem Kontakt mit Mn-Zn-Ferrit (b) und Bio-NCP (c). ). Die grünen Punkte stellen Regionen mit hoher Fe-Konzentration dar, wie durch EDS bestimmt, und die Einschübe zeigen vergrößerte Bilder der ausgewählten Regionen. Die deutlichsten morphologischen Veränderungen zeigen die Dickdarmkrebszellen nach Kontakt sowohl mit Mn-Zn-Ferrit als auch mit Bio-NCP.

Darüber hinaus zeigen die Einschübe in jeder Abbildung vergrößerte Bilder ausgewählter Bereiche, um zelluläre morphologische Veränderungen hervorzuheben. Diese Veränderungen wurden durch Vergleich der Verteilung des Seitenverhältnisses der Zellen bewertet, das sich auf das Verhältnis zwischen der Haupt- und Nebenachse einer Ellipse bezieht, die die Form jeder Zelle beschreibt, vor und nach ihrem Kontakt mit dem Mn-Zn-Ferrit und dem Bio- NCP-Nanopartikel. Unter diesen Linien weisen Seitenverhältnisverteilungen näher an 1 auf Zellen mit überwiegend sphärischer Form hin. Diese Ergebnisse sind in Abb. 3 dargestellt. Aus diesen Analysen erhält man ein mittleres Seitenverhältnis von 1,9 bzw. 1,5 für die Kontrollgruppe des Dickdarms und der Lunge. Interessanterweise zeigte die Verteilung des Seitenverhältnisses der Zellen nach Kontakt zwischen den Darmkrebszellen und sowohl Mn-Zn-Ferrit als auch dem Bio-NCP eine Abnahme um etwa 26 % und erreichte einen Mittelwert von 1,4. Für die Lungenzellen werden keine erkennbaren Veränderungen festgestellt.

Seitenverhältnisverteilungen, dargestellt durch Balken für (a) Dickdarm- (HCT116) und Lungenkrebs-Kontrollzellen (3LL) und für die Zellen nach 2-stündigem Kontakt mit (b) Mn-Zn-Ferrit und (c) Bio-NCP. Die morphologischen Veränderungen, die in den Darmkrebszellen nach Kontakt sowohl mit Mn-Zn-Ferrit als auch mit dem Bio-NCP deutlicher hervortreten, spiegeln sich in den schärferen Verteilungen wider. In jeder Abbildung stellen die Symbole die kumulative Häufigkeit der Seitenverhältnisse dar.

Schließlich wurde ein vorläufiger Zytotoxizitätstest der Materialien, einschließlich Bio-NCP + PTX, gegenüber gesunden Zellen durch In-vitro-Tests mit Fibroblasten durchgeführt, die hier als Modell für gesunde Zellen verwendet wurden und der Empfehlung von ISO 10 993-5 folgten . Wie in Abb. 4 dargestellt, weist die Lebensfähigkeit der Fibroblasten nach den Tests keinen signifikanten Unterschied im Vergleich zu den Ergebnissen der Kontrollgruppe auf, was auf keine signifikante Toxizität hinweist.

Lebensfähigkeitstest an Fibroblasten nach 24 Stunden in Kontakt mit den Mn-Zn-Ferrit-Nanopartikeln, dem Bio-NCP und dem Komplex Bio-NCP + PTX, der keine signifikante Toxizität zeigt.

Beachten Sie, dass es sich bei der Kontrollprobe um den Fibroblasten ohne Kontakt mit Material handelt.

Die in Abb. 5 (a) dargestellten NEXAFS-Spektren für PTX und Bio-NCP werden aufgrund der beträchtlichen Flexibilität der Kohlenstoffbindungen durch die Faltung der Anregungen verbreitert . Dennoch ist der PTX-Fingerabdruck bei 283,3 eV deutlich erkennbar und kann mit einer CC-π*-Bindung in Verbindung gebracht werden, die charakteristisch für aromatische Ringe ist. Ein Peak bei 286 eV im Spektrum von Bio-NCP könnte mit einem C1s → σ*-Übergang an den C-OH-Bindungen in Zusammenhang stehen, während die breite Bande bei 291 eV der Anregung von C-, H- und N-Bindungen von zugeordnet wird vernetztes Chitosan34. Der bemerkenswerte Peak im Bio-NCP-Spektrum bei 347 eV hängt mit der Ca-L3,2-Kante zusammen und weist auf die Apatitmodifikation auf der Chitosanoberfläche hin35.

NEXAFS-Spektren für PTX und das Bio-NCP (a). Das PTX-Spektrum zeigt einen charakteristischen Peak bei 283 eV, während das Bio-NCP-Spektrum charakteristische Übergänge bei 286 eV, 291 eV und 347 eV zeigt. In (b) die Karte der chemischen Zusammensetzung von Bio-NCP + PTX, die von STXM nach Durchführung einer Singulärwertzerlegung auf Bildern erhalten wurde, die mit Röntgenstrahlen mit den folgenden Energien gesammelt wurden: 275 eV, 283 eV, 286 eV, 300 eV, 320 eV und 347 eV. Das PTX ist in Gelb dargestellt, das Bio-NCP in Rot und die blaue Farbe entspricht den Hintergrundmaterialien, einschließlich der magnetischen Nanopartikel. Die grünen Punkte kennzeichnen Regionen mit niedriger PTX-Konzentration. Die Zusammensetzungskarte zeigt die Verteilung des PTX in der polymeren nHAP-Hülle.

Abbildung 5(b) zeigt die Karte der chemischen Zusammensetzung, die aus den STXM-Daten abgeleitet wurde. In dieser Karte wird das PTX durch Gelb und das Bio-NCP durch Rot dargestellt. Die blaue Farbe repräsentiert die Hintergrundmaterialien, einschließlich der magnetischen Nanopartikel. Die grünen Flecken, eine Mischung aus Gelb und Blau, kennzeichnen Regionen mit niedriger PTX-Konzentration. Das resultierende Bild zeigt, dass das Medikament entlang der Chitosan/nHAP-Hülle verteilt ist, wobei die magnetischen Mn-Zn-Ferrit-Nanopartikel den Kern des Bio-Nanokomposits bilden. Diese Verteilung bestätigt die erfolgreiche Einkapselung des Arzneimittels.

Um die Rückgewinnung von PTX nach längerer Exposition des Bio-NCP + PTX in wässrigen Medien zu überprüfen, wurde letzteres 7 Tage lang in Wasser bei 37 °C (menschliche Körpertemperatur) dispergiert, bei Raumtemperatur unter Vakuum getrocknet und untersucht FTIR. Alle spektralen Merkmale, die für die dispergierte Probe, Bio-NCP + PTX in der hergestellten Form und für das reine PTX spezifisch sind, werden mit den Ergebnissen der DFT-Berechnungen für das Gasphasenmolekül verglichen und in den Zusatzinformationen ausführlich erörtert. Das auffälligste Ergebnis war die Beobachtung der Moden bei 1535 und 1550 cm−1, die Benzolringen zugeordnet wurden. Diese Modi werden nach der Wirkstofffreisetzung wiederhergestellt und stehen im Zusammenhang mit der Antitumoraktivität von PTX7.

Der nächste wichtige Punkt zur Aufklärung des Freisetzungsprozesses war die Analyse der Wechselwirkungen des Arzneimittels mit seinem Träger. Dieser Schritt wurde durch die Kombination von INS-Experimenten mit DFT-Rechnungen am freien Molekül erreicht. Einzelheiten zu diesen Berechnungen, unterstützt bei der vollständigen Identifizierung der Schwingungsmerkmale in den Spektren durch Animationen für das reine und eingekapselte Arzneimittel, finden Sie in den Zusatzinformationen. Es ist erwähnenswert, dass die Berechnungen in der harmonischen Näherung durchgeführt werden, während die Schwingungsmodi unserer Materialien, insbesondere die Niederfrequenzmodi, wahrscheinlich anharmonische Modi sind. Die schematische Struktur des aus7 adaptierten PTX-Moleküls ist ebenfalls in den Zusatzinformationen dargestellt.

In Abb. 6(a) hängt das scharfe Maximum um 56 cm−1 mit dem akustischen Modus für H2O36 zusammen. Hier sollten wir uns daran erinnern, dass das in dieser Arbeit verwendete PTX eine Mischung aus hydratisierten und dehydrierten Formen ist37. Die Moden über 60 cm−1 werden Acetyl- und Phenylgruppen im PTX-Molekül zugeordnet und im (Bio-NCP + PTX-Bio-NCP)-Spektrum, das dem des eingekapselten PTX-Moleküls entspricht, nicht nachgewiesen. Dies weist darauf hin, dass das Molekül entweder stark eingeschränkt ist oder eine neue Konformation angenommen hat. Es ist jedoch auch klar, wie die Pfeile zeigen, dass einige dem PTX-Molekül zugeordnete höherfrequente Schwingungen tatsächlich im (Bio-NCP + PTX-Bio-NCP)-Spektrum verbleiben. Diese Schwingungen entstehen hauptsächlich durch Kohlenstoffe im Terpenring selbst sowie durch Gitterbewegungen, was bedeutet, dass die starre Struktur von PTX auch nach der Einkapselung erhalten bleibt. Wie in Abb. 6(b) gezeigt, werden verbleibende Methylschwingungen auch zwischen 200 cm–1 und 270 cm–1 erfasst, während die Moden über 300 cm–1 aufgrund schlechter Statistiken aus dem Subtraktionsverfahren schwach erscheinen. Wir kommen daher zu dem Schluss, dass die Unterdrückung der Acetyl- und Phenylgruppen höchstwahrscheinlich auf die Faltung des Moleküls zurückzuführen ist.

INS-Daten, die bei FDS zwischen (a) 20 und 200 cm−1 und (b) zwischen 200 und 500 cm−1 gesammelt wurden. In (a,b) zeigt die schwarze Kurve die PTX-Daten, während der gelb dargestellte Beitrag des eingekapselten Arzneimittels durch das Differenzspektrum zwischen den (Bio-NCP + PTX)- und (Bio-NCP)-Spektren dargestellt wird. Die Bio-NCP-Daten werden nicht angezeigt. INS-Spektren, die durch DFT-Rechnungen für das freie Molekül erhalten wurden, sind grün dargestellt. Im Differenzspektrum werden die den Acetyl- und Phenylgruppen zugeordneten Moden, die unterhalb von 80 cm−1 beobachtet werden, nicht erfasst, während die durch Pfeile angezeigten Schwingungen des Terpenrings im eingekapselten Arzneimittel weiterhin sichtbar bleiben. Dies weist darauf hin, dass die Mobilität der biologisch aktiven Gruppen von PTX stark eingeschränkt ist.

Unsere ersten In-vitro-Untersuchungen zeigen, dass bei Monozyten nach ihrem Kontakt mit den reinen Mn-Zn-Ferrit-Nanopartikeln oder mit dem Bio-NCP keine morphologischen Veränderungen beobachtet wurden. Nach Kontakt mit dem Mn-Zn-Ferrit wiesen jedoch mehrere Monozyten eine hohe Fe-Konzentration auf. Letztere Beobachtung deutet auf eine Interaktion und/oder Aufnahme der magnetischen Nanopartikel durch die Monozyten hin. Mittlerweile wurde in den Tests mit dem Bio-NCP eine sehr niedrige Fe-Konzentration festgestellt, was im Prinzip eine Folge der geringeren Fe-Konzentration im Vergleich zum reinen Ferrit sein könnte. Angesichts des im Abschnitt „Methoden“ beschriebenen Aufbaus dieses Experiments ist es jedoch plausibel anzunehmen, dass das Bio-NCP die Interaktion/Aufnahme der Monozyten hemmt. Weitere mit Dickdarm- und Lungenkrebszellen durchgeführte In-vitro-Tests deuten darauf hin, dass sowohl die Mn-Zn-Ferrit-Nanopartikel als auch das Bio-NCP interagieren und morphologische Veränderungen in Krebszellen, insbesondere solchen aus dem Dickdarm, verursachen. Diese Annahme basiert auf der Variation der Verteilung des Seitenverhältnisses, die zunächst für längliche Zellen charakteristisch war und sich nach der Wechselwirkung der für sphärische Zellen annäherte. Selbst in einem frühen Stadium ist dies ein ermutigendes Ergebnis, da die Invasivität von Darmkrebszelllinien mit ihrer verlängerten Morphologie in Verbindung gebracht wird38. Da außerdem die beobachtete Reaktion sowohl für Mn-Zn-Ferrit-Nanopartikel als auch für das Bio-NCP sehr ähnlich ist, ist es sinnvoll anzunehmen, dass der Bio-NCP-Effekt seinen Ursprung im magnetischen Kern hat. Tatsächlich wurden die Auswirkungen von Fe-basierten Nanopartikeln auf Krebszellen, einschließlich solcher aus dem Dickdarm, auf kontrollierte Fe-katalysierte reaktive Sauerstoffspezies (ROS) zurückgeführt, die möglicherweise Autophagie und den damit verbundenen Zelltod auslösen39,40. Folglich scheint diese Beobachtung darauf hinzudeuten, dass während dieses speziellen Experiments Fe-Ionen durch die Polymer/Apatit-Hülle des Bio-NCP freigesetzt werden. Andererseits kann die fehlende Toxizität gegenüber Fibroblasten mit der Verringerung der Fe-Toxizität gegenüber gesunden Zellen bei niedrigen Fe-Konzentrationen zusammenhängen41,42. Dies sind motivierende Ergebnisse für den Einsatz von Bio-NCP + PTX in der Krebsbehandlung, da es für gesunde Zellen ungiftig zu sein scheint. Diese Ergebnisse deuten jedoch auch darauf hin, dass der Wirkstoff entweder in einer sehr geringen Konzentration im Nanokomposit vorliegt oder unter den experimentellen Bedingungen des gewählten Protokolls nicht ohne weiteres freigesetzt wird. Um diese Frage zu beantworten, ist es notwendig, die PTX-Konzentration im Bio-NCP zu untersuchen. Eine Aufgabe, die aufgrund der Komplexität von Bio-NCP + PTX keineswegs einfach ist, was die Anwendung der gängigsten Techniken wie HPLC (Hochleistungsflüssigkeitschromatographie) zu einer Herausforderung macht und den Einsatz komplexerer Festkörperverfahren erforderlich macht Ansätze. Daher wurde durch die Kombination von NEXAFS und STXM eine Karte der chemischen Zusammensetzung für Bio-NCP + PTX erstellt. Diese Karte zeigt, dass eine erhebliche Menge des Arzneimittels tatsächlich im Chitosan und der nHAP-Hülle verteilt ist, was darauf hindeutet, dass die langsame PTX-Freisetzung höchstwahrscheinlich auf seinen Einschluss in der Matrix zurückzuführen ist.

Die letztgenannte Beobachtung machte uns darauf aufmerksam, dass wir verstehen müssen, wie der Einschluss die PTX-Dynamik beeinflusst. Diese Frage wurde durch die Kombination von INS und DFT beantwortet. Die Einfachheit der Neutronen-Kern-Wechselwirkung und der außergewöhnlich hohe inkohärente Streuquerschnitt des Wasserstoffatoms im Vergleich zu jedem anderen Element waren der Schlüssel zu einem solchen Verständnis43. Aus dieser Analyse kamen wir zu dem Schluss, dass die Mobilität der biologisch aktiven Gruppen von PTX, dh Acetyl- und Phenylgruppen, im Bio-NCP + PTX stark eingeschränkt ist. Man kann daher die Hypothese aufstellen, dass der Träger die Aktivität des PTX nicht nur als physikalische Barriere zwischen dem Arzneimittel und den Wirkortstellen einschränkt, sondern auch durch die Einschränkung der Bewegung an bestimmten Teilen des Moleküls. Nach der Freisetzung wurden diese Schwingungsbewegungen jedoch teilweise wiederhergestellt, wie mittels FTIR beobachtet wurde, was darauf hindeutet, dass das Antikrebsmittel möglicherweise seine aktive Form wiedererlangt.

Aus den Lebensfähigkeits- und INS-Ergebnissen geht nun klar hervor, dass die Arzneimittelfreisetzungsrate besser kontrolliert werden muss, bevor künftige Anwendungen von Bio-NCP + PTX in In-vivo-Studien in Betracht gezogen werden. Ein naheliegender Ansatz zur Umgehung des Problems wäre die Modifizierung der Bio-NCP-Struktur, d . Bevor jedoch in diese Richtung vorgegangen wird, müssen einige Fragen weiter berücksichtigt werden, beispielsweise die Bewertung des Freisetzungsverhaltens von PTX aus dem Bio-NCP in der Umgebung von Krebszellen. Der im Vergleich zu gesunden Zellen inhärente, etwas niedrigere pH-Wert der Umgebung könnte ausreichen, um das Chitosan-Netzwerk abzubauen oder zu entspannen45,46. Darüber hinaus sollte der Einsatz von Hochfrequenz als weitere Möglichkeit untersucht werden. In diesem Fall kann durch Erhitzen der magnetischen Nanopartikel27 das Polymernetzwerk entspannt werden, was wiederum die Wirkstofffreisetzung erleichtern könnte.

Abschließend berichten wir über ermutigende Ergebnisse bei der Anwendung eines neuen Bio-NCP als PTX-Träger. Wir schlagen außerdem neue Methoden für die Untersuchung eingekapselter Arzneimittel vor, die auf modernsten Streutechniken in Kombination mit theoretischen Berechnungen basieren. Die nächsten Schritte dieser Arbeit werden sich auf das weitere Verständnis der Einkapselungseffekte auf die Dynamik des freigesetzten PTX und seine Korrelation mit seiner biologischen Aktivität sowie auf die Optimierung des Wirkstofffreisetzungsmechanismus konzentrieren.

Der detaillierte Syntheseprozess zur Gewinnung des Bio-NCP ist an anderer Stelle beschrieben28. Kurz gesagt, aus Neutronenbeugungsergebnissen28 haben wir festgestellt, dass 0,41 mg Fe pro mg Nanopartikel aus einer Salzlösung ausgefällt und anschließend durch die Doppelemulsionsmethode in Chitosan eingekapselt wurden. Das Chitosan wurde dann durch Reaktion mit Glutaraldehyd vernetzt und ein abschließender Mimetisierungsprozess wurde durchgeführt, um die Oberfläche mit Apatit zu modifizieren, wodurch das Bio-NCP-Nanokomposit entstand. Abhängig von der Mimetisierungseffizienz, die nicht einfach zu bestimmen ist, da sie mit der effektiv in der Polymeroberfläche vorhandenen Apatitmenge zusammenhängt, kann die Fe-Menge pro mg im endgültigen Bio-NCP zwischen 0,20 mg (100 % Effizienz) und variieren 0,27 mg (0 % Effizienz). Das Bio-NCP + PTX wurde durch ein ähnliches Verfahren hergestellt, das die Zugabe von PTX zur Lösung vor der Vernetzung des Chitosans umfasste. Daher können wir davon ausgehen, dass die Höhe des Fe-Gehalts dem Bio-NCP + PTX ähnlich ist. Weitere Einzelheiten finden Sie in den Zusatzinformationen.

Gemäß der Deklaration von Helsinki wurden menschliche Monozyten aus peripherem Blut gesunder Spender isoliert. Alle gesunden Freiwilligen gaben ihre Einverständniserklärung ab. Die Studie wurde von der Ethikkommission für Gesundheitsforschung, Plataforma Brasil (http://aplicacao.saude.gov.br/plataformabrasil/login.jsf), mit der Entscheidungsnummer 1358038 und der CAAE-Nummer 50995715.9.0000.5411 genehmigt. Es wurden stabile Krebszelllinien verwendet, die vom Labor von Dr. Kaneno bereitgestellt wurden. Daher war keine Genehmigung der örtlichen Ethikkommission erforderlich. Die detaillierten Prozesse zur Herstellung von Zellkulturen werden in den ergänzenden Informationen beschrieben. Nach der Vorbereitung wurden die Zellen auf 2 × 105 Zellen/ml eingestellt und auf abgerundete Glasobjektträger (∅13 mm) verteilt, die zuvor mit Poly-L-Lysin beschichtet wurden. Um die Zellanheftung auf den Objektträgern zu fördern, wurden die Kulturen 2 Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO2 gehalten.

Die Glasobjektträger wurden dreimal mit warmem Vollkulturmedium (in den Zusatzinformationen beschrieben) (jeweils 1 ml) gewaschen und mit 50 μg reinem Ferrit oder Bio-NCP-Nanopartikeln interagieren gelassen. Die Zellkulturen wurden 2 Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO2 gehalten, um einen direkten Kontakt zwischen den Zelloberflächen und den Nanopartikeln zu ermöglichen. Die Objektträger wurden dann mit frischer phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) bei Raumtemperatur gewaschen, die Zellmonoschichten mit 2,5 % Glutaraldehyd fixiert und routinemäßig wie folgt einer mikroskopischen Analyse unterzogen.

Nach der Fixierung der Monoschichten auf den Objektträgern wurden die Zellen mit Ethanollösungen von 7,5, 15, 30, 50, 70, 90 und 100 % zweimal innerhalb von 10 Minuten für jede Alkoholkonzentration dehydriert und einer überkritischen Trocknung (über dem kritischen Punkt) unterzogen ) in einer CO2-Atmosphäre zur weiteren Metallisierung. Die Proben wurden anschließend mit Rasterelektronenmikroskopie (REM) analysiert (FEI, Quanta 200, ausgestattet mit einem Oxford, Inca, 250P20 EDS) und 7 Bilder (1000-fache Vergrößerung) wurden zufällig für jeden Objektträger gesammelt. Die Verteilungen des Seitenverhältnisses der Zellen wurden mit der Software ImagePro 4.1.0.0 ausgewertet. Es wurde keine Studie zur Bestimmung der Zellzahl durchgeführt; Daher wurden die Zellzahlen auf den Maximalwert normalisiert. EDS wurde verwendet, um die Fe-Konzentration über den Zellen abzubilden. Die Menge der Nanopartikel sowie die Geräteparameter wurden so eingestellt, dass bei gleicher Masse von Mn-Zn-Ferrit oder Bio-NCP das gleiche Signal/Rausch-Verhältnis erzielt wird.

Die Toxizität von reinem Ferrit, Bio-NCP und Bio-NCP + PTX wurde in Bezug auf Balb/c 3T3-Fibroblasten (Klon A31 – American Type Culture Collection) wie folgt bewertet. Zunächst wurden die Zellen wie in den Zusatzinformationen beschrieben verarbeitet, in 96-Well-Platten mit jeweils 5 × 104 Zellen verteilt und 24 Stunden in Kultur gehalten. Anschließend wurden 50 μg jeder Probe, also reines Ferrit, Bio-NCP und Bio-NCP + PTX, in denselben Kulturmedien suspendiert, die zur Kultivierung der Zellen verwendet wurden, und auf die Platten gegeben, um ihre Interaktion mit den Zellen zu ermöglichen. Nach 24 h wurde der Überstand, also der Überschuss an flüssigen und magnetischen Nanopartikeln, entfernt, die Zellen mit PBS-A gewaschen und einer Inkubation mit 3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium unterzogen Bromid (MTT) mit 0,5 mg MTT/ml DMEM für 4 Stunden. Dies führte zur Bildung des Formazanfarbstoffs in den lebenden Zellen, der in DMSO solubilisiert und mit einem Mikroplattenphotometer durch Ablesung bei 570 nm quantifiziert wurde. Die erhaltenen Absorptionswerte spiegeln die Lebensfähigkeit der Zellen wider. Die Experimente wurden in Duplikaten mit jeweils an = 6 durchgeführt.

PTX- und Bio-NCP-Proben wurden zur Abscheidung auf Siliziumnitridmembranen (Silson, England) in Ethanol dispergiert und zur Röntgenanalyse unter Verwendung des Kohlenstoff-K-Kanten-Photonenenergiebereichs (250 bis 350 eV) in eine Umgebung mit niedrigem Vakuum gebracht die PolLux-Strahllinie (Swiss Light Source am Paul Scherrer Institut, Schweiz)47,48,49. Für die STXM-Experimente wird ein monochromatischer Röntgenstrahl auf die Probe fokussiert und die gemessene durchgelassene Intensität wird verwendet, um ein Pixel-für-Pixel-Bild zu erstellen. Wenn die Röntgenphotonenenergie auf Resonanzmerkmale im NEXAFS-Spektrum abgestimmt wird, zeigen die STXM-Bilder starke Merkmale, die mit dem natürlichen Kontrast zusammenhängen, der auf der molekularen Bindung der konstituierenden Materialien basiert. Durch die Kombination eines Satzes von Bildern, die bei ausgewählten Photonenenergien erhalten wurden, mit den NEXAFS-Spektren der Komponentenmaterialien wird die Karte der chemischen Zusammensetzung der Probe mithilfe der Singulärwertzerlegung berechnet50. Daher wurden nach der Erfassung der NEXAFS-Spektren des PTX und des Bio-NCP STXM-Bilder für das Bio-NCP + PTX bei Röntgenenergien von 275 eV, 283 eV, 286 eV, 300 eV, 320 eV erhalten und 347 eV. Die Bilder und Spektren wurden mit dem Softwarepaket aXis200051 analysiert.

Die Schwingungsdynamik von PTX, Bio-NCP und Bio-NCP + PTX wurde mittels Neutronenspektroskopie mit dem FDS-Spektrometer am Lujan Center des Los Alamos National Laboratory (USA) bei 10 K untersucht. Durch den Einsatz dieses Spektrometers war dies möglich um molekulare Bewegungen zwischen 50 und 500 cm−1 zu beobachten. Die Proben wurden in versiegelten Aluminiumbehältern montiert und zur Korrektur der Daten wurde ein Vanadiumlauf verwendet.

Die Strukturoptimierung des Gasphasen-Paclitaxel-Moleküls bei 0 K und die anschließende Berechnung harmonischer Schwingungsfrequenzen wurden auf der Theorieebene B3LYP/6-31 + G(d′) unter Verwendung von Gaussian0952 durchgeführt. Die anfänglichen Atompositionen wurden der Kristallstruktur von 2-Carbamat-Taxol entnommen, beschrieben in Lit. 53. Frequenzen und Schwingungsamplituden aus der Gaußschen Berechnung wurden dann verwendet, um Intensitäten und Schwingungsspektren der inelastischen Neutronenstreuungsspektren mit dem Programm a_climax54 zu berechnen. Das FTIR-Spektrum für das PTX wurde ebenfalls berechnet und zur Modenzuordnung im Bereich von 1400 bis 1900 cm−1 verwendet.

Zitierweise für diesen Artikel: Martins, ML et al. Eine eingeschränkte Mobilität bestimmter funktioneller Gruppen verringert die Aktivität von Krebsmedikamenten in gesunden Zellen. Wissenschaft. Rep. 6, 22478; doi: 10.1038/srep22478 (2016).

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MLM und HNB waren an der Gestaltung der Experimente, der Datenanalyse und dem Verfassen des Manuskripts beteiligt. MLM, RI, BW, RK, WFZ, LD und MJS führten die Experimente und die Datenreduktion durch. JE stellte sein Fachwissen für die DFT-Berechnungen zur Verfügung. Dieses Manuskript wurde in seiner aktuellen Fassung von allen Co-Autoren genehmigt.

Die Autoren geben an, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Eingegangen: 29. Juni 2015

Angenommen: 08. Februar 2016

Veröffentlicht: 2. März 2016

DOI: https://doi.org/10.1038/srep22478

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